کلاژن دارای کاربرد های فراوانی در زمینه داروسازی و پزشکی، تهیه محصولات بهداشتی و آرایشی و صنایع غذایی می باشد. در سال های اخیر توجه زیادی به جداسازی کلاژن از موجودات دریایی شده است که علت آن عدم محدودیت استفاده از آن در رژیم غذایی و عدم ابتلا به بیماری های (Transmissible Spongiform Encephalopath) ؛ TSE و (BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy می باشد. هدف از انجام این تحقیق استخراج کلاژن از دیواره خیار دریایی parva Holothuria و مقایسه ساختاری آن با کلاژن نوع ۱ مهره داران می باشد.
مواد و روش ها: در این تحقیق جهت مقایسه ساختاری کلاژن حل شده با پپسین (Pepisn solubilized collagen) ؛ PSC استخراج شده از دیواره خیار دریایی جنس parva Holothuria و کلاژن نوع I مهره داران (Type I Calf skin) از آزمون های سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز (SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) ؛ SDS-PAGE، طیف بینی مادون قرمز تبدیل فوریه (Fourier Transform Infrared) ؛ FT-IR و کالریمتری روبشی دیفرانسیلی (Differential Scanning Calorimetry) ؛ DSC استفاده شده است.
یافته ها: الگوی پروتئینی SDS-PAGE کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده از دیواره خیار دریایی و نمونه کلاژن نوع I مهره داران نشان می دهد که قسمت عمده در هر دو کلاژن از زنجیره α۱ با وزن تقریبی ۱۳۰kDa و مقدار جزئی β وγ تشکیل شده اند با این تفاوت که در PSC استخراج شده از خیار دریایی به صورت ساختار α۱)۳) و در کلاژن نوع I مهره داران به صورت α۱)۲ α۲) می باشد. طیف FT-IR کلاژن حل شده با پپسین دارای یک باند پهن در ناحیه ۳۴۲۰cm-1 و باند تیز در ناحیه ۱۶۳۸cm-1 می باشد که شباهت زیادی به طیف FT-IR کلاژن نوع I مهره داران دارد. از آزمون DSC ماکزیمم دمای انتقالی PSC؛ ۴۶/۹۴ درجه سانتی گراد تعیین گردید که نشان دهنده پایداری حرارتی کمتر نسبت به کلاژن نوع I مهره داران (۶۲ درجه سانتی گراد) می باشد.
نتیجه گیری: کلاژن استخراج شده از خیار دریایی parva ؛Holothuria نوع I تعیین شده و با توجه به پایداری حرارتی مناسب می تواند در مصارف صنعتی مورد استفاده قرار گیرد. همچنین پایین بودن ماکزیمم دمای انتقالی کلاژن استخراج شده نشان دهنده محتوی کمتر ایمنو اسیدهای پرولین و هیدروکسی پرولین نسبت به کلاژن نوع I مهره داران می باشد.
واژه های کلیدی:خیار دریایی parva Holothuria، SDS-PAGE ،DSC ، FT-IR ، کلاژن حل شده با پپسین (PSC)
مقدمه
کلاژن فراوانترین پروتئین در بافت جانوران می باشد. مولکول کلاژن از سه پلی پپتید مجزا به نام زنجیرههای آلفا تشکیل می شوند که هرکدام حاوی بیش از ۱۰۰۰ آمینو اسید هستند(۱). فیبریل های کلاژن چارچوب عمده بیومکانیکی برای اتصال سلول و لنگر اندازی ماکرومولکول ها را فراهم می کند و موجب تعیین شکل بافت و حفظ و نگهداری آن می شود. فیبریل های بالغ کلاژن از فیبریل های اولیه (پروکلاژن) ۱۰ میکرومتری تشکیل شده اند که می توانند به طول صدها میکرومتر رشد کنند. پپتیدهای کلاژن دارای ظرفیت بالای نگه داری آب، فعالیت زیاد آنتی اکسیدانی و پتانسیل بالای کاهش فشار خون می باشند (۲).
پپتیدهای کلاژن غنی از آمینو اسید های آب گریز هستند. این آمینو اسیدها که در هنگام هیدرولیز با آنزیم و یا طی فرآیند تهیه غذا آزاد می شوند دارای خاصیت آنتی اکسیدانی قوی می باشند. آمینو اسید پرولین که در کلاژن به وفور وجو دارد در مقابل اکسیداسیون بسیار مقاوم می باشد خصوصاً در موقعیت های که اتم هیدروژن به گروه عاملی OH و یا گروه های عاملی دارای اتم نیتروژن متصل باشد (۴و۳).
کلاژن کاربرد های فراوانی در زمینه داروسازی و پزشکی ، تهیه محصولات بهداشتی و آرایشی و صنایع غذای دارد (۵).
کلاژن همچنین کاربرد های فراوانی را در داروسازی و مهندسی بافت از جمله ساخت دریچه های قلبی و پوست مصنوعی را داشته است (۶).
کلاژن در داروسازی می تواند به اشکال ورقه ای، لوله ای ،اسفنجی، پودر و محلول های قابل تزریق ساخته شود (۸و۷).
در سال های اخیر توجه زیادی به جداسازی کلاژن از موجودات دریایی شده است که علت آن عدم محدودیت استفاده از آن در رژیم غذایی و عدم ابتلا به بیماری های TSE و BSE می باشد(۹).
رشته های کلاژن پستانداران استوانه ای شکل بوده اما در خارپوستان دوکی شکل می باشد. رشته های کلاژن خارپوستان دو قطبی با سر آمیدی و سرکوبوکسیلی هستند ولی رشته های کلاژن در پستانداران به شکل تک قطبی می باشد (۱۰).
Matsumura در سال ۱۹۷۳ و ۱۹۷۴ با انتشار اولین مقالات در زمینه مطالعه مورفولوژیکی و تهیه و خالص سازی فیبرل های کلاژن از خیار دریایی جنس Stichopus در این زمینه پیشرو بوده است(۱۱).
در سال ۱۹۸۲Bailey با انتشار مقاله ای تحت عنوان تناقض اتصالات متقاطع وسیع و مقاومت مکانیکی پایین در کلاژن استخراج شده از فیلامنت های چسبناک سفید خارج شده از در اثر تحریک مکانیکی Cuvierian Tubule خیار دریایی Holothuria forskali تحقیق در زمینه مطالعه کلاژن استخراج شده از خیار دریایی را ادامه داد(۱۲).
با این وجود هنوز دانش بسیار مختصری از کلاژن استخراج شده از خیار دریایی و خواص ترکیبات شیمیایی آن وجود داشت تا اینکه در سال ۲۰۰۲، Saito با انتشار مقاله ای در ارتباط با شناخت کلاژن خیار دریایی جنس Stichopus به این سوالات پاسخ داد(۱۳).
Cuiدر سال ۲۰۰۷ با انتشار مقاله ای در ارتباط با شناسایی کلاژن استخراج شده از خیار دریایی Stichopus به همراه تعیین دمای پایداری حرارتی Thermal Stability Temperature آن اطلاعات جدید تری در ارتباط با شناخت کلاژن استخراج شده از این خیار دریایی ارائه داد (۱۴).جدیدترین فعالیت تحقیقاتی در سال ۲۰۱۰ توسط Liu در ارتباط با خالص سازی کلاژن از خیار دریایی جنس Parastichopus و مطالعه ساختاری آن انجام شده است (۹).
با توجه به برنامه های موجود در سند راهبردی بیوتکنولوژی کشور و اینکه تاکنون هیچگونه تحقیقی در ارتباط با جداسازی و شناسایی کلاژن از خیار دریایی در ایران انجام نشده است، تحقیق و مطالعه در این زمینه (استخراج ترکیبات با ارزش نظیر کلاژن از منابع دریایی) می تواند مفید باشد و موجب گسترش کاربرد رشته بیوتکنولوژی دریایی گردد.
اهداف کلی اجرای این پژوهش عبارتند از:
- جداسازی و خالص سازی کلاژن محلول در پپسین (PSC) از دیواره خیار دریایی جنس Holothuria parva
- شناسایی ساختاری کلاژن جداسازی شده با استفاده از آزمون های SDS-PAGE ، FT-IR و DSC
- مقایسه نتایج حاصل از این پروژه با کلاژن نوع I مهره داران و سایر تحقیقات انجام شده بر روی کلاژن استخراج شده از سایر جنس های خیار دریایی و سایر جانوان دریایی
مواد و روش ها
جمع آوری نمونه
مطابق مقالات و تحقیقات انجام شده ، ۶ عدد خیار دریایی جنس parva Holothuria با میانگین وزن ۱۰۰ گرم و طول ۱۸ سانتی متر از سواحل جنوبی ایران از اطراف اسکله شهید بهشتی چابهار در طول و عرض جغرافیایی (N41/05،’۱۷،º۳۵ و E01/44،’۳۶،º۶۰ ) جمع آوری شدند
(۱۴و۹). عملیات جمع آوری در آذر ماه ۱۳۸۹ با کمک غواص انجام شد و با استفاده از یخ خشک به آزمایشگاه دام، طیور و آبزیان پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری منتقل گردید (شکل ۱). کلیه نمونه ها در سردخانه آزمایشگاه در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان شروع آزمایشات نگهداری شد.
تمامی مراحل در یخچال ۴ درجه سانتیگراد انجام شده است.
(۹).
بریدن پوست خیار دریایی به قطعات ریز
ابتدا وزن یک خیار دریایی parva Holothuria را به کمک ترازوی با دقت ۰٫۰۰۱ گرم وزن کرده و پوست را از امعاء و احشاء داخلی جدا کرده و با کمک یک قیچی به قطعات ریز تبدیل شد.
مرحله شستشو
۱۰۰ گرم از قطعات پوست را با ۲ لیتر آب مقطر در یک ارلن مخلوط کرده و به مدت ۳۰ دقیقه در ۴ درجه سانتیگراد استیرر گردید. این مرحله ۲ بار تکرار شده و در هر بار آب مقطر را دور ریخته و با ۲ لیتر آب مقطر مجدداً استیرر گردید(۹).
جداسازی کلاژن از دیواره خیار دریایی
تکه های خیار دریایی را با یک لیتر محلول EDTA ؛ ۴ میلی مولار و Tris-HCl؛ (pH=8)؛ ۰٫۱ مولار مخلوط شده و به مدت ۲۴ ساعت در سرد خانه آزمایشگاه در ۴ درجه استیرر گردید. مخلوط حاصله توسط دستگاه سانتریفیوژ مدل (Biofuge stratus Heraous Model) با دور ۹۰۰۰g به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. شناور را دور ریخته و رسوب با یک لیتر آب مقطر به مدت ۳۰ دقیقه استیرر گردید و سپس سانتریفیوژ شد. رسوب حاصله با ۱ لیتر آب مقطر مخلوط شده و به مدت ۲۴ ساعت استیرر گردید(۹).
حل کردن مواد غیر کلاژنی
مخلوط حاصل از مرحله قبل را از یک پارچه تنظیف عبور داده و ذرات نامحلول را جدا کرده و مایع فیلتر شده در دور ۹۰۰۰g به مدت ۳۰ دقیقه در ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. سپس رسوب با ۱۰۰ میلی لیتر محلول NaOH؛ ۰٫۱ مولار به مدت ۷۲ ساعت در سرد خانه ۴ درجه استیرر گردید.
خارج کردن NaOH از محیط
در این مرحله محلول حاصله را در دور ۹۰۰۰g به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کرده و شناور را دور ریخته و رسوب با ۱ لیتر آب مقطر مخلوط شده و به مدت ۳۰ دقیقه استیرر گردید. سپس pH آن را اندازه گیری کرده و بعد در دور ۹۰۰۰g به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. رسوب را دوباره با یک لیتر آب مقطر مخلوط کرده و pH آن اندازه گیری شد و آنقدر این مراحل را تکرار کرده تا pH آن به pH آب مقطر نزدیک شود.
استخراج کلاژن محلول در پپسین
رسوب مرحله قبل را وزن کرده و به مقدار ۱ درصد از وزن آن آنزیم پورسین پپسین ( ساخت شرکت Merck) به همراه استیک اسید ۰٫۵ مولار اضافه کرده و به مدت ۴۸ ساعت در سردخانه ۴ درجه سانتی گراد استیرر شد. محلول بدست آمده در دور ۱۲۰۰۰g به مدت ۱ ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ (SIGMA 3k30 centrifuge) شد. شناور را جمع آوری کرده و به رسوب باقی مانده، دوباره به مقدار ۱ درصد وزنی/وزنی آنزیم پورسین پپسین به همراه استیک اسید ۰٫۵ مولار اضافه کرده و مجدداً به مدت ۴۸ ساعت استیررگردید. محلول را در دور ۱۲۰۰۰g به مدت ۱ ساعت در دمای ۴ درجه سانتریفیوژ کرده و شناور جمع آوری شده به شناور قبلی اضافه شد. به شناور حاصله، محلول ۰٫۸ مولار NaCl اضافه شد و به مدت ۲۴ ساعت در ۴ درجه سانتیگراد استیرر گردید. سپس این محلول را در دور ۹۰۰۰g به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کرده و بعد ۵۰ میلی محلول استیک اسید ۰٫۵ مولار به آن اضافه کرده و محلول حاصله را در کیسه دیالیز ریخته و در مقابل Na2HPO4 02/0 مولار(pH=8) و استیک اسید ۰٫۱ مولار به مدت ۱۲ ساعت دیالیز شد.
نهایتاً کلاژن حل شده در پپسین بدست آمده با دستگاه Freeze Dryer مدل CoolSafe SCANVAC ساخت دانمارک خشک شد. در این مرحله نمونه ها با کمک نیتروژن مایع ابتدا منجمد و سپس طی مدت ۷۲ ساعت در دستگاه مذکور خشک می گردد(۹).
آزمون SDS-PAGE
برای انجام این آزمون از ژل پلی آکریل آمید ۳۰٫۸% استفاده شد. در این مرحله از ژل پایین ۱۲٫۵% و از ژل بالای ۴% استفاده شد. پودر کلاژن محلول در پپسین و کلاژن نوع I مهره داران در بافر نمونه و آب مقطر حل شده و به مدت۵ دقیقه در آب جوش گذاشته شد و سپس هر دو روی ژل منتقل گردیدند و نهایتاً الکتروفورز با ولتاژ ۱۲۰ به مدت ۴ ساعت انجام شد. بعد از الکتروفورز، ژل باکوماسی آبی به مدت ۲۰ دقیقه رنگ آمیزی گردید. سپس با محلول رنگ بر شامل متانول ، استیک اسید گلاسیال و آب مقطر رنگ بری صورت پذیرفت (۱۵).
آزمون DSC
DSC (گرماسنجی روبشی تفاضلی) رایج ترین تکنیک آنالیز حرارتی است که انتقالات حالات و فازها را در مواد غذایی نشان می دهد. گرماسنجی پروتئین ها به طور معمول با استفاده از این تکنیک انجام می شود. DSC دما را اسکن می کند و ظرفیت گرمایی نمونه را در فشار اتمسفر اندازه گیری می کند. تکنیک DSC شکلی از گرماسنجی است که در آن گرمای مبادله شده در واکنش ها و فرآیندها اندازه گیری می شود (۱۶).
با استفاده از دستگاه DSC131 ساخت شرکت SETARAM فرانسه بیشترین دمای انتقالی (TS) کلاژن استخراج از خیار دریایی parva Holothuria بدست آمد. مقدار ۴۰ میلی گرم از پودر کلاژن خشک شده توسط دستگاه Freeze-dryer را در ۱ میلی لیتر آب دی یونیزه حل کرده و محلول کلاژن به مدت ۲۴ ساعت در دمای محیط نگهداری شد.
سپس ۵۰۰ میلی گرم از محلول را وزن کرده و به درون ظرف مخصوص خوب می چسبانیم سپس دستگاه از دمای ۲۰ تا ۸۰ درجه سانتی گراد با سرعت افزایشی ۱ درجه سانتی گراد بر دقیقه راه اندازی شد(۹).
آزمون طیف بینی FT-IR
طیف بینی مادون قرمز یکی از تکنیک های مورد استفاده برای تعیین ساختار ثانویه پلی پپتید ها و پروتئین ها است. این تکنیک طیف بینی دارای قابلیت عدم تخریب نمونه می باشد. در این طیف بینی گروه های عاملی موجود در ترکیبات مختلف دارای قدرت جذب متفاوت اشعه های مادون قرمز در ناحیه های مختلف عدد موج را دارا می باشند. اطلاعات طیف بینی مادون قرمز تحت عنوان ارتعاشات واحد ساختاری (گروه های عاملی) نمودار می شوند.
باندهای آمید I و آمید II از باند های غالب در ساختاری پروتئین و پلی پپتید می باشند. حساسترین ناحیه در طیف باند آمیدی I با عدد موج cm-1؛۱۶۰۰-۱۷۰۰ است که متعلق به ارتعاشات کششی پیوند C=O دراتصالات پپتیدی پلی پپتید یا پروتئین می باشد. در مقایسه با آن باندهای آمید II متعلق به ارتعاشات پیوند CN می باشد (۱۷). به منظور مطالعه و بررسی گروه های عاملی PSC استخراج شده از خیار دریایی جنس Holothuria parva در ابتدا با استفاده کمپرسور دستی از کلاژن نوع I مهره داران و کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده تحت فشار۱۰ تن قرص KBr تهیه شد. سپس قرص های حاصله را در سل مخصوص دستگاه FT-IR مدل TENSOR27 ساخت شرکت BRUKER قرار داده و با استفاده از نرم افزار OPUS آنالیزهای مربوطه انجام شده و طیف مربوطه تهیه گردید(۱۸).
یافته ها
نتایج آزمون SDS-PAGE
کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده از خیار دریایی جنس Holothuria parva با کمک SDS-PAGE شناسایی شد. وزن مولکولی جزء غالب آن در حدود kDa130 مشاهده شد و این وزن ملکولی مشابه کلاژن نوع I مهره داران می باشد ( شکل ۲)(۹).
وجود باند پهن در وزن ملکولی مذکور نشان دهنده حضور رشته های α (سه زنجیره α) می باشد. همچنین واحد های زیر ساختاری β وγ (اجزاء غیر غالب) در شکل (۲) مشاهده می شوند
نتایج آزمون DSC
در منحنی ترموگرام DSC (شکل ۳) مشاهده می شود با افزایش درجه حرارت منحنی از ناحیه گرما زا به ناحیه گرماگیر منتقل شده تا اینکه از دمای ۴۶٫۹۴ درجه سانتی گراد یعنی دمای انتقالی کلاژن محلول در پپسین این روند معکوس شده و با افزایش درجه حرارت منحنی دوباره به ناحیه گرما زا نزدیک می شود.
نتایج آزمون طیف بینی FT-IR
همانطور که در شکل های (۴) و (۵) مشاهده می شود طیف FT-IR کلاژن حل شده با پپسین دارای یک باند پهن در ناحیه ۳۴۲۰cm-1 است که نشان دهنده ارتعاشات کششی پیوند های آزاد N-H آمینو اسید ها در ساختار پلی پپتیدی کلاژن می باشد (۱۷).باند تیز در ناحیه ۱۶۳۸cm-1 نشان دهنده ارتعاشات کششی پیوند C=O آمینو اسید ها موجود در ساختار کلاژن می باشد. گروه عاملی N-H بعنوان یک گروه الکترون دهنده موجب شیفت گروه C=O در ناحیه مذکور شده است بطوری که باند ارتعاشی این گروه عاملی در عدد موج پایینتری در طیف FT-IR ظاهر شده است(۱۷).
بحث
الگوی پروتئینی SDS-PAGE کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده از خیار دریایی جنس parva Holothuria و نمونه کلاژن نوع I مهره داران (Type I Calf skin) نشان می دهد که قسمت عمده در هر دو کلاژن از زنجیره α۱ با وزن تقریبی ۱۳۰KDa تشکیل شده اند با این تفاوت که PSC استخراج شده از دیواره خیار دریایی مورد مطالعه parva) Holothuria ( دارای ساختار ۳(α۱) در حالی که کلاژن نوع I مهره داران به صورت α۱)۲ α۲) می باشد.
این نتیجه مشابه نتایج گزارش شده از خیار های دریایی Stichopus japonicus و Parastichpus californicus با ساختار ۳(α۱) و با وزن مولکولی به ترتیب ۱۳۵ و۱۳۸ کیلودالتون می باشد (۱۴و۹).
پایین تر بودن ماکزیمم دمای انتقالی بدست آمده از منحنی ترموگرام DSC کلاژن حل شده با پپسین خیار دریایی جنس parva Holothuria از دمای انتقالی کلاژن نوع I مهره داران ( ۶۲ درجه سانتی گراد) نشان می دهد که مارپیچ کلاژن بدست آمده از دیواره خیار دریایی مورد مطالعه پایداری حرارتی کمتری نسبت به کلاژن نوع I مهره داران دارد. هرچه میزان ایمینو اسید هیدروکسی پرولین و پرولین در ساختار کلاژن بیشتر باشد ماکزیمم دمای انتقالی کلاژن بیشتر خواهد بود. ماکزیمم دمای انتقالی کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده از خیار دریایی Parastichpus californicus ؛ ۳۳٫۲ درجه سانتی گراد می باشد (۹).
بیشترین دمای انتقالی (۵۷ درجه سانتی گراد) و در نتیجه بیشترین پایداری حرارتی مربوط به کلاژن حل شده با پپسین استخراج شده از خیار دریایی japonicus Stichopus می باشد (۱۴).
میزان محتوی ایمینو اسیدی (مجموع پرولین و هیدروکسی پرولین) در کلاژن نوع I مهره داران و خیار های دریایی Stichopus japonicus و Parastichpus californicus به ترتیب residues/1000residues ۲۱۵، ۱۶۱ و ۱۵۳ گزارش شده است (۱۴و۹).
با توجه به ماکزیمم دمای انتقالی مشاهده شده در کلاژن نوع I مهره داران و خیار های دریایی Stichopus japonicus و Parastichpus californicus نتیجه گیری می شود میزان محتوی ایمینو اسیدی کلاژن استخراج شده از خیار دریایی جنس parva Holothuria کمتر از residues/1000residues 161 و بیشتر از ۱۵۳ می باشد. همچنین محتوی ایمینو اسیدی کلاژن استخراج شده بسیار کمتر از کلاژن نوع I مهره داران است.
همانطور که از طیف FT-IR کلاژن نوع I مهره داران مشخص است باند هایی در ناحیه amide A با طول موج ۳۴۴۲cm-1 و amide I با عدد موج ۱۶۵۴cm-1 و amide III با طول موج ۱۲۳۶cm-1 وجود دارند. باند های مشاهده شده در ناحیه amide III نشان دهنده حضور ارتعاش کششی CN و خمشی N-H ساختار ثانویه کلاژن نوع I است.
شباهت طیف های FT-IR کلاژن نوع I مهره داران و کلاژن استخراج شده از parva Holothuria بخصوص در ناحیه amide A و ناحیه amide I دلیل دستیابی به کلاژن حل شده با پپسین با ساختار نزدیک به کلاژن نوع I می باشد.